Guido Bertolaso nasce a Roma il giorno 20 marzo 1950. Consegue la laurea in Medicina e Chirurgia con lode nel 1977 presso l'Università degli Studi di Roma "La Sapienza", poi perfeziona i suoi studi a Liverpool con un Master in malattie tropicali.
 
Con in mente l'esempio umanitario e il mito di Albert Schweitzer (medico premio Nobel) a 27 anni parte per l'Africa. Ovunque vi sia un'epidemia di colera arriva in soccorso: viaggia quindi tra Mali, Senegal, Burkina Faso, Niger e Somalia. Poi, dopo l'invasione vietnamita e la caduta di Pol Pot Bertolaso viene inviato in Cambogia ad amministrare il nuovo ospedale nella giungla. Quando arrivo scopre che l'ospedale non c'è, così si dà da fare per costruirlo.

L'Unicef gli offre il posto di direttore in Somalia. Ma arriva la chiamata dalla Farnesina per diventare responsabile dell'assistenza sanitaria ai Paesi in via di sviluppo, lavoro che lo occuperà per tutti gli anni '80.
 
Nel gennaio 1990 viene nominato Dirigente Generale della Presidenza del Consiglio dei Ministri, cui si aggiunge, nel marzo dello stesso anno, la nomina a Capo del Dipartimento per gli Affari Sociali.
 
Con la nomina a Vice Direttore esecutivo dell'Unicef a New York, nel 1993 diventa responsabile della nuova politica dell'Unicef su diritti dell'infanzia e adozioni internazionali, lotta contro lo sfruttamento minorile, prostituzione, pedofilia, mine antiuomo e interventi umanitari dell'Unicef.
 
Nel 1996 è nominato Commissario di Governo per l'apertura dell'Ospedale Lazzaro Spallanzani, specializzato per le malattie infettive e la lotta all'AIDS.
 
All'inizio dell'anno 1998 viene nominato Vice Commissario vicario per il Grande Giubileo dell'anno 2000: in questo contesto Guido Bertolaso è responsabile di tutte le attività operative connesse all'organizzazione dei principali eventi Giubilari, compresa la GMG (Giornata Mondiale della Gioventù) di Tor Vergata.
 
Dal settembre 1998 e fino al 2002 ricopre la carica di Direttore Generale dell'Ufficio Nazionale per il Servizio Civile.
 
Il 7 settembre 2001, con nomina del Consiglio dei Ministri, XIV Legislatura, è nominato Capo del Dipartimento della Protezione Civile Nazionale. Tale nomina viene poi rinnovata dal Consiglio dei Ministri della XV Legislatura il 9 giugno 2006.
 
Come Commissario straordinario tra il 2000 e il 2010 ha coordinato i lavori per gestire diverse situazioni delicate e di emergenza quali il terremoto dell'Aquila, i vulcani nelle Eolie, le aree marittime di Lampedusa, la bonifica del relitto della Haven, il rischio bionucleare, i mondiali di ciclismo, la presidenza del G8 del 2009, l'area archeologica romana, l'emergenza rifiuti a Napoli e i funerali di Papa Giovanni Paolo II.
 
Il 4 febbraio 2010 è confermato Sottosegretario di Stato alla Presidenza del Consiglio dei Ministri fino al 31 dicembre 2010 per il coordinamento degli interventi di prevenzione in ambito europeo ed internazionale rispetto ad eventi di interesse di protezione civile.
 
Durante la sua lunga e blasonata carriera è stimato da molti politici di diversi schieramenti (Andreotti, Prodi,Amato, Rutelli, Berlusconi).
 
Il 10 febbraio 2010 viene emesso un avviso di garanzia nell'ambito di un'inchiesta sui lavori del G8 a La Maddalena: Guido Bertolaso decide di dimettersi dal suo incarico di Capo della Protezione Civile, tuttavia le dimissioni vengono immediatamente respinte dal Presidente del Consiglio Silvio Berlusconi.
 
Nel mese di novembre 2010 abbandona i propri incarichi e si ritira in pensione. Torna in campo pubblico nel febbraio 2016, quando gli viene chiesto dai partiti di centrodestra di candidarsi come sindaco di Roma.